蛋白酶降解靶向嵌合物（PROTACs）是一類異雙功能分子，目前正在實現其作為靶向蛋白質降解的治療策略的潛力。然而，現有設計的缺陷是缺乏對蛋白質降解有效載荷的細胞選擇性靶向。本文報道了Burley團隊發表的一篇關于HER2+細胞系中受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（RIPK2）的細胞靶向降解方法，實現PROTAC骨架的細胞選擇性傳遞的潛力。

蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）是一種異雙功能分子，可以選擇性地降解目標蛋白（POI）。[1,2]PROTACs的作用機制（MoA）是POI和E3連接酶形成三元復合物，然后給靶蛋白打上泛素化的標簽，隨后通過泛素?蛋白酶體途徑降解。[3,4]這些蛋白質降解劑的一個特點是其降解過程具有催化性質，使得PROTAC從三元復合物解離后能夠再循環利用。這種作用機制相較于傳統的非共價抑制具有更持久的藥理效應，在體內使用劑量較低。[5?9]與傳統的抑制劑策略相比，PROTACs的另一個優勢是最終需要與POI結合并進行降解，而不是通過與小分子的化學計量相互作用來調節蛋白質功能。[10]

目前，PROTACs應用的一個主要缺陷是缺乏細胞選擇性和可變的細胞滲透性，[11]這反映在其次優的藥代動力學特性上。[12,13]細胞靶向模塊融入PROTAC設計中，可以將PROTAC載荷輸送到所需的細胞類型，并降低脫靶毒性（Figure1A）。

一種新興的細胞選擇性遞送PROTACs平臺是將其與抗體（Ab）結合。[14]抗體藥物偶聯物（ADCs）選擇性地將分子載荷（如PROTAC）傳遞到特定的細胞類型，從而避免了對PROTAC骨架的細胞攝取進行大量優化的需求（Figure1B）。雖然已經開發出了Ab-PROTAC用于細胞選擇性降解BRD4和ERα的研究，[15?17]但連接化學（可裂解vs不可裂解）、藥物在目標細胞中的積累以及通過Ab結合可靶向多樣的POI的影響仍處于起步階段。在這里，作者擴展了Ab-PROTAC結合物的范圍，并展示了在HER2+細胞系中對絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶2（RIPK2）的細胞選擇性和靶向性降解（Figure1C）。

作者通過二硫化物重連試劑（二溴吡嘧啶二酮，diBrPD），將RIPK2 PROTAC分別與抗HER2單克隆抗體（mAb），曲妥珠單抗,和抗IL-4帕索利珠單抗（陰性對照）偶聯起來，分別得到了ADC-2和ADC-3。在SKOV3 HER2+卵巢癌細胞系中評估了使用ADC-2和ADC-3對RIPK2的降解作用。與原始PROTAC相比，抗HER2的ADC-2顯示出類似的RIPK2降解水平，而抗IL-4的ADC-3在10nM濃度下沒有發生降解。意外發現是，在100nM以上的濃度下使用ADC-3進行RIPK2降解（Figure3A）。由于SKOV3細胞沒有膜結合的IL-4，觀察到的降解可能是由于非特異性攝取機制，可能是巨噬細胞吞噬作用所致。[18]

為了證實RIPK2降解是通過泛素?蛋白酶體途徑發生的，作者在SKOV3細胞中加入已知的蛋白酶體抑制劑MG132（濃度為10μM），然后用PROTAC 1、ADC-2或ADC-3處理細胞，沒有觀察到任何化合物的降解，這證實了降解是通過蛋白酶體依賴的途徑發生的（Figure3C）。在ADC-1和ADC-2在1μM范圍內均未觀察到細胞毒性（Figure3D），也排除連接子的不穩定性導致PROTAC的過早釋放。

然后在HEK293 HER2-細胞系中使用HiBiT實驗檢測ADC-2和ADC-3的細胞選擇性靶向性。這兩個ADC-2和ADC-3在較高濃度下表現出RIPK2的降解，當濃度超過100nM時，降解效果更為顯著。

這與在SKOV3細胞中觀察到的類似降解可能是由于非特異性細胞攝取的事實相一致。重要的是，與使用PROTAC 1時降解50%相比，兩種偶聯物在10nM時均未觀察到降解（Figure 4A）。同樣，所有化合物均未觀察到細胞毒性（Figure 4B）。

總之，作者通過使用Ab-PROTAC偶聯物，在HER2+SKOV3細胞中展示了對RIPK2的細胞選擇性降解。這種方法補充了ADC的發展，并且為使用具有次優物理化學性質的PROTAC或需要在特定細胞中選擇性傳遞PROTAC載荷的情況下提供了設計策略，為藥物開發和治療提供了新的可能性。

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